کلونینگ، بیان و تعیین مشخصات پروتیین نوترکیب میتونین گاما لیاز

زمینه و هدف: میتونین گاما لیاز از خانواده لیازها و آنزیمهای وابسته به پیرودکسال فسفات است که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور را به آلفاکتواسیدها، آمونیا و تیول کاتالیز می نماید. از آنجا که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور نظیر هموسیستیین و میتونین نقش مهمی در فرآیندهای بیولوژیکی داشته و میزان آنها در بدن با برخی بیماریها نظیر هموسیستینوریا مرتبط است از این رو اندازهگیری و شناسایی آنها حایز اهمیت می باشد. میتونین گاما لیاز در نقش معرفهای تشخیصی در آنالیزهای آنزیمی، ساخت کیتهای غربالگری و زیست حسگرها مورد استفاده قرار می گیرد. از این رو دستیابی به آنزیمهایی از این خانواده که دارای ویژگیهای کاتالیزی متمایز باشند از اهمیت قابل توجهی برخوردار است. روشها: ابتدا ژن آنزیم از سوش Citrobacter freundii جدا شده و سپس با کمک روشهای مهندسی ژنتیک فرم نوترکیب آن تولید شد. بیان آنزیم نوترکیب توسط روشهای سنجش فعالیت بیولوژیک و SDS- PAGE تایید شده و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید. خصوصیات کینتیکی و فیزیکو شیمیایی آنزیم تولید شده نظیر پارامترهای کینتیکی، دما و pH بهینه ی فعالیت و پایداری آنزیم، pH ایزوالکتریک، ترکیب آمینواسیدی و جرم مولکولی نیز مطالعه شدند. .نتایج: بهترین شرایط برای تولید میتونین گاما لیاز نوترکیب با 0/5 IPTGمیلی مولار در دمای 32 درجه سانتی گراد و زمان القاء 5 ساعت به دست آمد و فعالیت آنزیم تولید شده، 3100 U/ml محاسبه شد. ترادف نوکلیوتیدی آنزیم، پروتیینی به طول 293 آمینواسید را کد می نمود و وزن مولکولی هر زیر واحد توسط الکتروفورز SDS-PAGE، 32 کیلو دالتون تخمین زده شد. بحث و نتیجه گیری: در مجموع، ژن آنزیم میتونین گاما لیاز از باکتری C. freundii جداسازی و کلون شد و فرم نوترکیب آن در E. coli بیان گردید..

کلیدواژه ها:

میتونین گاما لیاز ، بیان ، تخلیص ، .2Citrobacter freundii