مطالعهی تاثیر بیان گاماکربوکسیلاز دروزوفیلایی بر فاکتور IX انسانی بیان شده در ردهی سلولی HEK_293

فاکتورIXانعقادی انسانhFIX یک پروتئین وابسته به ویتامین Kاست که نقص در آن منجر به هموفیلی نوعBمیشود. تیمار کنونی برای این بیماری جایگزین درمانی با فرآوردههای پلاسمایی یاFIX نوترکیب است. گاماکربوکسیلاسیون تعدادی از گلوتامیکاسید های دمینGlaی فاکتورIX برای فعالیت زیستی آن ضروری است و سلول پستاندار به عنوان بهترین میزبان تولید پروتئینهای نوترکیب دارویی انسان، از ظرفیت کافی برای گاماکربوکسیلاسیون کامل پروتئین بیشبیان شده برخوردار نیست. بنابراین، گاماکربوکسیلاسیون عامل محدودکنندهی تولید فاکتورIX به شمار میرود. اخیراً با شناسایی آنزیم گاماگلوتامیل کربوکسیلاز در دروزوفیلا dγC نشان داده شده که این آنزیم قادر به شناسایی پروپپتید فاکتورIXو پروترومبین انسانی بوده و نسبت به همتای انسانی خود، دارایKmکمتر و توان گاماکربوکسیلاسیون بیشتری میباشد. هدف این تحقیق استفاده از ظرفیت بالای آنزیم دروزوفیلا در بهینهسازی تولید فاکتورIX گاماکربوکسیله و دارای عملکرد میباشد. بدین منظور، توالیهای رمزگذار مربوط بهhFIX و dγCبا استفاده ازRT-PCRتکثیر و بطورمستقل در دو مرحلهی متوالی در وکتورهایT/Aکلونینگ و سپس درpcDNA3 همسانهسازی شدند. سازههای به دست آمده، پس ازتأیید با استفاده از برش آنزیمی و تعیین توالی، به سلولهایHEK293Tانتقال یافته و بیانhFIXدر حضور و در غیاب بیانdγCارزیابیشد. بررسی میزان بیان، فعالیت و گاماکربوکسیلاسیونhFIXحاصله، به ترتیب با استفاده از آزمونهای الایزا، انعقاد و رسوبدهی باریم سیترات انجام گرفت. نتایج نشان دادند که بیان همزمانdγCبه طور معنیداری، منجر به افزایش بیان فاکتورIXو افزایش میزان گاماکربوکسیلاسیون فاکتورI Xترشح شده از سلولها میگردد. در نتیجه بیان توأم آنزیمdγCمیتواند به عنوان راهکاری برای بهبود تولیدپروتئینهای گاماکربوکسیله مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه ها:

هموفیلی ، فاکتورIX انعقادی انسان ، گاماکربوکسیلاز ، دروزوفیلاملانوگاستر