بهینه سازی تکنیک SOEing (Splicing Overlap Extension) PCR برای ایجاد موتاسیون هدفمند دراسترپتوکیناز نوترکیب

یکی از مهمترین تکنیک های مورد استفاده در ایجاد موتاسیون هدفمند در ژن ها، استفاده از تکنیک SOEing PCR می باشد.برخلاف سادگی این تکنیک گاهی برای ایجاد موتاسیون در نقاط خاصی از یک ژن مشکل ایجاد می می شود. در این تحقیق موتاسیونهدفمند برای ایجاد اسیدآمینه سیستیین در جایگاه اسیدگلوتامیک 263 استرپتوکیناز با تکنیک SOEing PCR و بهینه سازی آن انجام شد. از نرم افزار GENERUNNER برای طراحی پرایمر های لازم برای تکثیر و و ایجاد موتاسیون استفاده شد. برای ایجاد موتاسیون به روش SOEing PCR ابتدا قطعات همپوشان دارای موتاسیون تکثیر شدند و برای ایجاد ژن کامل، قطعات با هم مخلوط شده و با تکنیک PCR تکثیر شدند. برای بررسی درستی اندازه و غلظت ژن از روش الکتروفورز و اسپکتروفوتومتری با نور UV استفاده شدو برای بررسی درستی ایجاد موتاسیون، ژن موتاسیون یافته تعیین توالی شد. با افزایش غلضت بافر استفاده شده در این تکنیک، غلظت محصول موتاسیون یافته و همچنین میزان وضوح باند ها پس از الکتروفورز، در مقایسه با روش استفاده از غلظت معمول (1X)، به مقدار زیادی افزایش یافت. استفاده از این پروتکل برای انجام SOEing PCR باعث تولید غلظت بالایی از محصول جهش یافته شد. باتوجه به این که غلظت و خلوص محصول موتاسیون یافته برای انجام مطالعات بعدی مهم می باشد نتایج این مطالعه برای محققیناستفاده از این تکنیک بسیار مفید خواهد بود.

کلیدواژه ها:

موتاسیون هدفمند ، SOEing PCR ، استرپتوکیناز