همسانه سازی و بیان ژن سلوبیوهیدرولاز cel B در مخمر Pichia pastoris

آنزیم Cel6B از باکتری Thermobifidia fusca، یک CBHII متعلق به خانواده بی سلولازهاست که بسیار مقاوم به حرارت است. به علت میزان پایین تولید این آنزیم در میزبان اولیه نمیتوان از این میزبان برای تولید آنزیم در مقیاس صنعتی استفاده نمود. به منظور بیان این آنزیم در مخمر، ژن سلوبیوهیدرولاز موجود در سازه PSZ143 با PCR تکثیر و به درون ناقل مخمری pPICZ A، همسانه سازی شد. سازه نوترکیب حاوی ژن cel B، به باکتری E. coli Jm109 منتقل شده و باکتریهای نوترکیب بر روی محیط کشت LB حاوی 0/5 ʽg/ml بلیومایسین، انتخاب شد. سازه نوترکیب خطی شده، با استفاده از الکتروپوریشن به مخمرPichia pastoris سویه های GS115 و KM71H منتقل شد. در نهایت بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم نیز با روش DNS تعیین شد. نتایج نشان داد، بیشترین میزان فعالیت سلوبیوهیدرولاز در سویه های GS115 و KM71H و بر روی PC (پنبه اسید فسفریک شده) در دمای 50°C و به مدت 16 ساعت، به ترتیب 1/98 و 0/475 U( mol/min)/ml است. نمونه مربوط به کلنی پر محصول سویه GS115 بر روی ژل SDS-PAGE بارگزاری و بیان آنزیم تایید شد و سپس نتایج بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم با همین سویه، در روز چهارم بعد از القاء با 3 درصد متانول (V/V) به دست آمد. عدم بهینهسازی کدون های ژن همسانه شده به پلاسمید مخمری باعث کاهش بیان و کاهش فعالیت سلوبیوهیدرولازی آن شد. مخمر پیشیا میزبان مناسبی برای بیان این آنزیم است که با بهینه سازی کدونهای توالی کدکننده این ژن، می توان بازدهی بیان را بهبود داد.

کلیدواژه ها:

مخمر ، سلوبیوهیدرولاز ، فرآوری زیستی تلفیقی ، ژن cel6B