تعیین توالی نوکلیوتیدی، ابزاری جهت مطالعات بیولوژی مولکولی

تعیین ردیف نوکلیوتیدی DNA یکی از ابزارهای بسیار مهم مطالعات بیولوژی مولکولی است. مطالعات مولکولار اپیدمیولوژی تعیین فیلوژنی اجرام، درج ردیف های ژنی اجرام در بانک های اطلاعات ژنی جهان، کارهای مربوط به پروتیین های نوترکیب بروز ژنها درپلاسمیدهای مختلف تشخیص تایید تشخیص ارگانیسم های مختلف، همگی از کاربردهای تعیین ردیف نوکلیوتیدی می باشند. اساس کار استفاده از دی داکسی نوکلیوتید تری فسفات هایی (ddNTPs) است که با رنگ های فلیورسنت متفاوتی کنژوگه شده باشند. این مواد به همراه dNTP معمولی اگر در یک واکنش PCR بکار گرفته شوند محصولاتی با طول های بسیار متفاوت ایجاد می کنند. علت آن است که ddNTP ها در وضعیت به جای گروه OH دارای یک انتهایی بوده به محض قرار گرفتن در سیر سنتزDNA موجب عدم امکان اتصال نوکلیوتید بعدی به رشته DNA شده موجب توقف ادامه روند سنتز DNA می شوند. در چنین شرایطی به ازای هر نوکلیوتید الگو محصولی ایجاد خواهد شد که به یک ddNTP ختم شده باشد. راندن چنین محصولی بر روی ژل وقرایت آن در اسکنرهای لیزری خاص منحنی هایی را حاصل می نماید که هر موج منحنی یک نوکلیوتید را نمایندگی می کند از آنجایی که هر موج با رنگ ویژه ای نشان داده می شود به راحتی می توان ردیف نوکلیوتیدی را مشخص نمود. نرم افزارهای رایانه ای فراوانی برای مشاهده نتایج تعیین ردیف نوکلیوتیدی وجود دارد که می توان علاوه بر مشاهده به تنظیم پاکسازی ردیف ها نیز پرداخت. بهتر است محصول PCR به روش پاکسازی از روی ژل اطمینان از خلوص محصول برای تعیین ردیف ارسال شود. روش دیگر آن است که محصول PCR در یکی از پلاسمیدهای A-T کلون شده سپس برای تعیین ردیف ارسال گردد. حسن این روش آن است که اولا از خلوص حداکثری محصول پلاسمیدی می توان اطمینان حاصل نمود نیز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی پلاسمیدابتدا انتهای محصول کلون شده را دقیقا تعیین ردیف نمود. امروزه کیت های متعددی برای تعیین ردیف نوکلیوتیدی طراحی به بازار عرضه شده است. محتویات هر کیت از dNTP، ddNTP، آنزیم DNA پلیمراز، پیروفسفاتاز rTth کلرید منیزیم تشکیل شده است. این کیت ها به شکلی تهیه شده اند که قدرت تعیین ردیف برای DNAهای تک دو رشته ای در واکنش PCR را دارند.

کلیدواژه ها:

بیولوژی ، توالی نوکلیوتیدی ، PCR ، سکانس ژن ، DNA