کلونینگ ژن کیتیناز از میکروارگانیسم های کیتینولاکتیک ایزوله شده از کارگاه های پرورش میگو

هدف: کیتینازها توسط بسیاری از پاتوژن های موجودات دریایی تولید می شوندو به پوسته سخت پوستان نفوذمی کنند. ایفای نقش پاتوژنسیته توسط این میکروارگانیسم موجب بروز عفونت های گسترده ای در آبزیان می شود. از سویی دیگر کیتینازها عوامل موثری در کنترل بیولوژیک قارچ های فیتو پاتوژن هستند و برای تغذیه موجودات آبزی، در تولید Single Cell Protein کاربرد دارد. پسماندهای پوسته میگو برای احیای کیتین و تولید آنزیم های کیتینولایتیک مورد استفاده قرار می گیرد. اهداف : 1. مطالعه بیوانفورماتیکی آنزیم کیتیناز 2. طراحی پرایمر و تکثیر کیتیناز 3. کلون کردن ژن کیتیناز از میکروارگانیسم ها 4. توالی یابی ژن کیتیناز مواد و روش کار: DNA ژنومی با کیت سیناژن ازباکتری استخراج و آغازگرهای مناسب طراحی شد. واکنش PCR در حجم 100 میکرولیتر در دستگاه ترموسایکلر با برنامه 5 دقیقه در94 درجه و سپس 35 سیکل به ترتیب 30 ثانیه در 94 درجه ،30 ثانیه در 55 درجه ،90 ثانیه در 72 درجه انجام گردید. تخلیص محصول PCR با کیت metabion انجام گرفت . E. coli در محیط L.B کشت شد. همسانه سازی با استفاده از Ins T/A Clone MT PCR Product Cloning Kit,Fermentas در حال انجام است . DNA به وکتور pTZ57R/Tمتصل و به پلاسمیدa_E. coli DH5 اتصال خواهد یافت . نتایج و بحث : انتروباکتر کلوآسه جداسازی شده از پساب کارگاه های پرورش میگو در آبادان به عنوان بهترین باکتری تولید کننده کیتیناز معرفی شد. DNA استخراج شد وکیفیت و کمیت DNA استخراجی توسط اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز ژلی بررسی شد. با استفاده از پرایمر های طراحی شده قطعه شامل ژن کیتیناز از باکتری تکثیر داده شد.این قطعه DNA به وکتور pTZ57R/T متصل خواهد شد. پلاسمید نو ترکیب ساخته شده به باکتری a _E. coli DH5 انتقال خواهد یافت . باکتری مستعد به مدت یک ساعت همراه با محصول Ligation جهت ترانسفورماسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه خواهدشد. درمحیط LB کلنی های سفید رنگ به عنوان کلون های حاوی قطعه مورد نظر انتخاب و آزمون Clony PCR روی آن ها انجام خواهد شد. کیتینازها می توانند عوامل موثری در کنترل بیولوژیک قارچ های فیتو پاتوژن باشند. امکان استفاده از ژن کلون شده کیتیناز در جهت بازیافت ماده سخت کیتین به عنوان یکی از آلاینده های محیط زیست در خشکی و دریا نیز وجود دارد. در این راستا تحقیقاتی در زمینه استفاده از میکروارگانیسم ها وترشحات حاصله از آنها در حال گسترش می باشد که اساس آن بر پایه انتخاب میکرو ارگانیسم ها با فعالیت ضد میکروبی وایزوله کردن آن ها تمرکز یافته است

کلیدواژه ها:

کلونینگ ، کیتیناز ، میکروارگانیسم ، میگو