راه اندازی و استفاده از روش RFLP- PCR بر روی ژن سیتو کروم – ب میتوکندری برای تشخیص آلودگی های متقاطع لاین های سلولی

مقدمه :تحقیق حاضر معرفی روش جدیدی به منظور صرفه جویی در زمان و هزینه است که در تشخیص گونه حیوانی که لاین سلولی از آن بر گرفته شده است و همچنین منشا آلودگی های متقاطع بین گونه ای در میان کشتهای مختلف سلولی است . تشخیص دو مورد فوق در تهیه و توسعه بانک سلولی بسیار حایز اهمیت میباشد.یکی از فاکتورهای خطر در آزمایشگاه کشت سلول آلودگی متقاطع و عدم وجود روش سریع حساس و دقیق و کم هزینه برای تمایز بین لاین های سلولی است .روش کار: برای این منظور براساس واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از جفت پرایمر که به قطعه سیتوکرومb میتوکندری اتصال می یابدروشی بسیار حساس راه اندازی گردید.این روش کاربردی دو منظوره دارد اول اینکه میتواند آلودگی متقاطع بین لاین های سلولی مختلف که در آزمایشگاه بوجود آمده را تشخیص دهدو دیگر اینکه قادر است منشا گونه حیوانی و یا انسانی هر لاین سلولی را به صورت 100% تشخیص دهد.برای این کار پس از تهیه لاین سلولی استخراج DNAصورت گرفت و سپس با استفاده از جفت پرایمر که به قطعه سیتوکرومb میتوکندری اتصال می یابد PCR ،انجام شد سپس محصول تکثیر شده تحت تاثیر شش آنزیم محدودالاثر قرارگرفت . سپس روی ژل 3% آگارز برده شد. نتایج حاصل از برش آنزیمها باهمدیگر مقایسه گردید. در مرحله دوم با استفاده از پرایمر اختصاصی گونه نتایج حاصل مورد اعتبار سنجی قرار گرفت. در تمام آزمون ها از کنترل های مثبت و منفی برای ارزیابی دقت آزمون استفاده شدو در پایان حساسیت آزمون با مخلوطی از رقتهای مختلف سنجیده شد. نتایج : با این روش شش لاین سلولی متعلق به شش گونه ی متفاوت انسان ، میمون, خرگوش , جوجه و سگ بر اساس برش آنزیمی متفاوت تفریق گردید و همزمان وجود و یا عدم آلودگی متقاطع این لاینها نیز بررسی شد. این روش در مقایسه با روش ایزوآنزیم از صحت و دقت بالاتری برخوردار است و نیاز به زمان کمتری برای انجام دارد. ارزیابی حساسیت و ویژگی این تست نشان داد که قادر است تا حد5 در صد آلودگی DNA در هر واکنش را ردیابی کند.کلمات کلیدی : آلودگی متقاطع ، واکنش زنجیره ای پلیمراز ، آنزیم محدودالاثر