نقد به مقاله " آنالیز منحنی ذوب DNA با کیفیت بالا (HRM) به منظور شناسایی استافیلوکوک اورئوس و سویه مقاوم به متی سیلین "

سردبیر محترم   با آن که حوزه مقاومت به متی سیلین از اهمیت زیادی برخوردار بوده ولی مطالعات ناقص فراوانی در این خصوص گزارش شده است(۱). با آن که روش high-resolution melting curve analysis برای تشخیص بسیاری از ژن های پروکاریوتی و یوکاریوتی گزارش شده است(۴-۲)، نویسندگان محترم به جای Resolution واژه quality را به کار برده و به عنوان یک روش بسیار حساس برای تشخیص استافیلوکوکوس آرئوس مطرح کرده اند، درحالی که این روش برای تشخیص بسیاری از ژن ها کاربرد دارد. بنابراین، لازم است به نکاتی اشاره شود: ۱- عنوان مقاله : در عنوان مقاله، آنالیز منحی ذوب DNA با کیفیت بالا به منظور شناسایی استافیلوکوکوس آرئوس ذکر شد. این روش برای شناسایی سایر باکتری ها نیز کاربرد دارد و افزایش کیفیت ذوب به درجه خلوص و ترکیب بازهای DNA استخراج شده بستگی دارد و نه چیز دیگر. هم چنین، ابهام دیگری در عنوان وجود دارد زیرا، معلوم نیست باکتری مورد نظر به متی سیلین مقاوم بوده و یا دو باکتری مجزا از هم هستند. از عنوان این گونه استنباط می شود که مطالعه فوق از دو سویه استافیلوکوکوس آرئوس، یکی مقاوم به متی سیلین و دیگری حساس بوده است. ۲- مقدمه : جستجو در پاپ مد نشان می دهد طی ۱۰ سال گذشته حدود ۲۷ عنوان مقاله در خصوص متی سیلین چاپ شده از ایران وجود دارد که به خوبی و به طور شایسته از آن ها بهره گیری نشده است. هم چنین در مقدمه از ژن ITS نام برده و به رفرنس شماره هفت ارجاع داده است که تناسب ندارد. از ۶۰ تا سویه استافیلوکوکوس معرفی شده در سایت in silico ؛ ۹ سویه استافیلوکوکوس آرئوس فاقد ژن ITS هستند (تصویر شماره ۱) و مشخص نیست که آیا همه سویه هایی که این ژن را دارند به متی سیلین مقاوم باشند و یا درصد مقاومت آن ها یکسان باشد. ۳- مواد و روش ها : رقت های ارایه شده مناسب نمی باشند. زیرا، ذکر شده است که از سوسپانسیون معادل استاندارد ۵/۰ مک فارلند (CFU/ml ۱۰۸ × ۵/۱) رقت های ذکر شده در زیر را   تهیه نموده است که مناسب نیستند.       تصویر شماره ۱: واکنش PCR مجازی با پرایمر های استفاده شده در  مطالعه فوق توسط نرم افزار in-silico   اگر خواننده فرض نماید که این غلظت ها نماینده تعداد سلول باکتری در هر میلی لیتر باشد. سوسپانسیون ده به توان صفر (۱۰۰) یعنی یک عدد باکتری در هر میلی لیتر، حال اگر آن را ۱۰ ، ۱۰۰ ، ۱۰۰۰، و ۱۰۰۰۰ برابر رقیق نمایند چند عدد باکتری یا به عبارت دیگر چند CFU در هر میلی لیتر بوده است ؟ معلوم نیست رقت ۱۰۷ از استاندارد ۵/۰ مک فارلند تهیه شده یا از چیز دیگری؟ به همین ترتیب معلوم نیست رقت ۱۰۴ و ۴-۱۰ دارای چند عدد سلول باکتری بوده اند؟ شایسته است محقق محترم ژن استخراج شده از هر رقت را اندازه گیری و غلظت DNA را برای هر رقت بیان کند تا بتواند به طور دقیق حساسیت کار را بیان نماید. مدل ارایه شده برای اختصاصیت صحیح نیست، مگر این که برای آن رفرنس و دلیل علمی ذکر شده باشد. هر ۱۲ رقت ذکر شده از یک ژن نشان دهنده اختصاصیت نیست، اختصاصیت زمانی ایجاد می شود که پرایمر مورد نظر به قطعات ژنی سایر باکتری ها یا سایر ژن ها به غیر از استافیلوکوکوس نچسبد. ۴- یافته ها : در نتایج حساسیت برای ژن ITS ده هزار باکتری و برای ژن mecA هزار سلول باکتری بیان شده است و در شکل نیز نشان داده شده است. در حالی که حساسیت روش تشخیص این ژن ها در حد ۱۰ سلول باکتری گزارش شده است(۵). بیان این اعداد قابل قبول نیست، ازطرفی محقق محترم می توانست با اسکن نمودن غلظت باندها و یا تعیین غلظت DNA موجود در هر یک از رقت ها و مقایسه با منابع موجود تعداد CFU را به طور دقیق محاسبه نماید. پاسخ به نقد مقاله " آنالیز منحنی ذوب DNA با کیفیت بالا (HRM) به منظور شناسایی استافیلوکوک اورئوس و سویه مقاوم به متی سیلین "   محمد رضا عربستانی دانشیار، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران مرکز تحقیقات بروسلوز، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران   سردبیر محترم ضمن تشکر از خواننده محترم و ارائه نظرات ارزشمند ایشان، توجه خواننده عزیز را در خصوص موارد ذکر شده به نکات ذیل جلب می نمایم: ۱- عنوان مقاله : البته که تکنیک high-resolution melting curve analysis (HRM) ، برای شناسایی بسیاری از ژن ها مورد استفاده قرار می گیرد، ولی با توجه به این که این مطالعه برای شناسایی و تشخیص باکتری استافیلوکوکوس آرئوس و ژن مقاوم به متی سیلین در استافیلوکوکوس آرئوس مورد استفاده قرار گرفته است، با این عنوان معرفی شده است. ۲- مقدمه : در خصوص عدم بهره گیری از مقالات چاپ شده از ایران طی ده سال اخیر که منتقد محترم به آن اشاره نموده اند باید ذکر شود که با توجه به این که هدف شناسایی باکتری استافیلوکوک و سویه مقاوم به متی سیلین با روش high-resolution melting curve analysis (HRM)، بوده، نه اپیدمیولوژی سویه های مقاوم به متی سیلین آن، بنابراین هم در مقدمه مقاله منابع شماره ۱۱، ۱۲، ۱۴، ۱۶ و هم در قسمت بحث مقاله، منابع شماره ۲۲ الی ۲۶ در زمینه تکنیک HRM صحبت کرده اند که به خوبی از آن ها استفاده شده است. در رفرنس شماره ۷ نواحی بین ۱۶S-۲۳ S rRNA مورد بررسی قرار گرفته است که منظور همان نواحی ITS می باشد. ناحیه ITS برای شناسایی جنس و گونه باکتری استافیلوکوکوس آرئوس استفاده می شود، نه برای شناسایی ژن مقاومت به متی سیلین، که البته ممکن است بعضی از سویه های استافیلوکوکوس آرئوس دارای ژن mec نیز باشند و بعضی ژن mec را نداشته باشند، بنابراین ممکن است ارتباطی بین ژن ITS, و مقاومت به متی سیلین وجود نداشته باشد. ۳- مواد و روش ها : در ارتباط با رقت های به کار رفته در انجام مطالعه لازم است ذکر شود که، همان طوری که در صفحه شماره ۸۶ مقاله قسمت روش کار، بخش حساسیت و اختصاصیت پرایمرها اشاره شده است، تمامی رقت های تهیه شده بر مبنای ۵/۰ مک فارلند صورت گرفته است و حداقل مقدار آن CFU/ml ۰۰۰۱۵/۰ یا همان ۴-۱۰ x ۵/۱ در نظر گرفته شده است. لزوما تهیه رقت های کم تر از ۱۰۰ جهت تعیین میزان حساسیت بوده است که برخی دیگر از محققین از جمله Ericksen نیز از این رقت ها استفاده کرده اند(۱). همان طوری که مستحضر هستید برای تهیه رقت بایستی OD یا جذب نوری DNA نیز اندازه گیری شود که با دستگاه نانودراپ این کار انجام شده است. در خصوص مدل ارائه شده برای اختصاصیت در مطالعه حاضر باید اشاره شود که، جهت تعیین اختصاصیت پرایمر ITS و mecA در روش HRM، دمای ذوب پرایمر مورد استفاده برای سویه های استاندارد استافیلوکوکوس آرئوس مقاوم به متی سیلین مورد ارزیابی قرار گرفت و با رسیدن به دمای۸۶ و ۸۱ درجه سانتی گراد به ترتیب برای پرایمرهای ITS و mecA، اختصاصیت پرایمرها مشخص شد. البته، با استفاده از سایر باکتری ها در کنار سویه های استاندارد به عنوان کنترل منفی، پرایمرهای مورد نظر قادر به شناسایی سایر باکتری ها در این دما نبودند. در این جا صرفا به خاطر جلوگیری از پیچیدگی تصاویر، شکل هایی اختصاصی برای این دو ژن یعنی ITS و ژن mecA آورده شده و از ذکر تصاویر دیگر خودداری شده است. ۴- یافته ها : در تصویر شماره ۱ که اعداد بالا ذکر شده، تصویرمربوط به ژل آگارز می باشد که همان گونه که مستحضر هستید قدرت تفکیک ژل آگارز در مقایسه با روش Real TimePCR بسیار پایین تر می باشد که یک امر بدیهی است.

کلیدواژه ها:

Letter to editor ، Letter to editor ، Letter to editor ، نقد ، نقد ، نقد