ایجاد رده سلولی پایدار جهت تولید فسفولیپاز نوترکیب A۲ زهر زنبورعسل (آپیس ملیفرا)

زمینه مطالعه: زهر زنبور عسل دارای ترکیبات پیچیده ای مانند پلی پپتیدها، آنزیم ها و آمین ها می باشد. از اجزای مهم زهر زنبور عسل، آنزیم فسفولیپازA۲  است که به عنوان یک آلرژن مهم زهر زنبور عسل مطرح می باشد و در درمان برخی از بیماری ها کاربرد دارد. این آنزیم در حشرات دیگر، آراکنیدها، مارها و سلول های پستانداران یافت می شود و عملکرد آن هیدرولیز پیوند استری دوم گلیسروفسفولیپیدها و آزاد شدن اسیدهای چرب و لیزوفسفولیپیدها می باشد. پروتئین های نوترکیب توسط ترانسفکشن موقت قابل تولید می باشند، اما جهت تولید در مقیاس بالا با صرفه اقتصادی، سلول های پایدار مناسب ترند.هدف: مطالعه حاضر باهدف ایجاد رده سلولی پایدار جهت تولید فسفولیپاز نوترکیب A۲ زهر زنبورعسل (آپیس ملیفرا) انجام شد.روش‎کار: وکتور PCDNA حاوی ژن فسفولیپاز  A۲از کمپانی ماکروژن تهیه شد. پلاسمید نوترکیب با روش شوک حرارتی به سلول های CHO منتقل شد و بیان ژن در محیط کشت HamsF۱۲ حاوی آنتی بیوتیک نئومایسین صورت گرفت. پس از ازدیاد رده های پلی کلونال حاوی پلاسمید، کلون های مونوکلونال توسط روش رقت محدود  (limiting dilution)انتخاب شدند. سپس اقدام به تکثیر کلون های مونوکلونال، جمع آوری و تغلیظ سوپ سلول های انتخاب شده گردید و با انجام آزمایش SDS-PAGE بیان پروتئین مذکور ارزیابی شد.نتایج: نتایج الکتروفورز که جهت تایید بیان ژن فسفولیپازA۲  در سوپ سلول ها انجام شد یک باند با وزن مولکولی ۲۰ کیلودالتون را نشان داد که موید ایجاد رده سلولی پایدار جهت تولید فسفولیپاز A۲ نوترکیب زهر زنبور عسل است.نتیجه­گیری نهایی: پس از ترانسفکشن موقت پلاسمید حاوی این ژن، تعدادی از سلول های حاوی پلاسمید به واسطه داشتن سازوکارهای ترمیمی دچار نوترکیبی شدند و ژن مورد نظر همراه با ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را در ژنوم خود قرار دادند که با اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت می توان این سلول ها را انتخاب کرد و سپس به بسط و تکثیر آن ها پرداخت.

کلیدواژه ها:

رده سلولی پایدار ، رده سلولی CHO ، زهر زنبورعسل ، فسفولیپاز A۲ ، وکتور PCDNA