کلونینگ، بیان ژن و خالص سازی کربوکسی پپتیداز جدید از گونه هالوفیل Bacillus persicus دریاچه فوق شور آران و بیدگل

پروتئازهای میکروبی به دلیل کاربرد گسترده در صنایع شوینده، دارویی و فرآوری خوراک دام درصد بالایی از کل بازار آنزیم­های صنعتی را به خود اختصاص می­دهند. گونه های جنس Bacillus، قابلیت بالایی در تولید و ترشح مقادیر بالای آنزیم­ پروتئاز را دارند که از فعالیت­های فیزیولوژیک آن­ها نشات می­گیرد. در این مطالعه، ابتدا ژن کد کننده کربوکسی پپتیداز از گونه Bacillus persicus به وسیله PCR و با استفاده از آغازگرهای دارای جایگاه های برش NdeI و XhoI جدا شد. پس از هضم آنزیمی محصول PCR، قطعه ژن در بین جایگاه های مورد نظر در حامل بیانی pET۲۸a+ کلون شد و پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی E. coli BL۲۱(DE۳) ترانسفورم شد. پلاسمیدهایی که Colony PCR آنها مثبت بود جهت تایید نهایی برای تعیین توالی ارسال شد. بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط دمایی و در زمان های مختلف انجام شد و تخلیص پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز صورت پذیرفت. بیشترین سطح بیان در غلظت ۴/۰ میلی مولار IPTG در دمای ۳۲ درجه سانتی گراد و مدت زمان ۲۰ ساعت انکوباسیون تعیین شد. وزن مولکولی پروتئین نوترکیب کربوکسی پپتیداز حدود ۵۸ کیلودالتون بود. با توجه به مقدار بالای بیان پروتئین محلول و بهینه سازی آسان بیان و خالص سازی آن در شرایط آزمایشگاهی، چنانچه فعالیت آنزیمی در حضور سوبستراهای استاندارد به­ مقدار مناسب باشد و همچنین اگر مطالعات تکمیلی امکان تولید بهینه و به صرفه مقدار بالایی از این آنزیم را در حجم بالا و شرایط نیمه صنعتی نشان دهد، می توان امیدوار بود که این آنزیم گزینه مناسبی برای تولید نیمه صنعتی باشد.

کلیدواژه ها:

Bacillus persicus ، Protease ، Carboxypeptidase ، pET۲۸a+