همسانه سازی، و بررسی بیان ژن Mannose-۶-phosphate reductase (M۶PR) گیاه کرفس در باکتری اشرشیاکلی جهت کنترل مسیر کاتابولیسم
محل انتشار: فصلنامه بیوتکنولوژی کشاورزی، دوره: 15، شماره: 2
سال انتشار: 1402
نوع سند: مقاله ژورنالی
زبان: فارسی
مشاهده: 56
فایل این مقاله در 18 صفحه با فرمت PDF قابل دریافت می باشد
- صدور گواهی نمایه سازی
- من نویسنده این مقاله هستم
استخراج به نرم افزارهای پژوهشی:
شناسه ملی سند علمی:
JR_JOAGK-15-2_011
تاریخ نمایه سازی: 8 مهر 1402
چکیده مقاله:
هدف: اطلاعات کمی در مورد متابولیسم قند و نحوه ادغام آن با سایر مواد، در مقایسه با سایر محصولات فتوسنتزی اولیه (مانند ساکارز و نشاسته) وجود دارد. Mannose-۶-phosphate reductase (M۶PR) یک آنزیم کلیدی است که در بیوسنتز مانیتول در کرفس نقش دارد. هدف از این پژوهش همسانه سازی ژن، بررسی بیان ژن و تخلیص آنزیمM۶PR و بررسی عملکرد آن بر روی ژنهای جهش یافته در محیط آزمایشگاهی بوده است. مواد و روش ها: ابتدا استخراج mRNA از گیاه کرفس انجام شدو سپس سنتز cDNA صورت گرفت و محصول به عنوان الگو در تکثیر ژن M۶PR مورد استفاده قرار گرفت..محصول PCR توسط کیت استخراج DNA از روی ژل، تخلیص شد. محصول PCR خالص شده مطابق با دستور العمل T/A Cloning (فرمنتاز) در ناقل pTZ۵۷R همسانه سازی شد. سلول مستعد E.coli سویه Top۱۰ با استفاده از روش بیوشیمیایی کلرید کلسیم تهیه شد و وکتور نوترکیب درون آن ترانسفورم و روی پلیت حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند. صحت کلونینگ با استفاده از PCR ژنM۶PR و هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های BamHI, SacI (شرکت فرمنتاز) انجام گرفت. سپسژن M۶PR در پلاسمید بیانی pET۳۲a همسانه سازی شد و درون باکتری E.coli سویه BL۲I انتقال داده شد. پیشبر ژن با IPTG القا شد و با وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین تولید شده با ستون کروماتوگرافی تمایلی (His.Tag/S.Tag) تخلیص شد. نتایج: نتایج نشان دادند که آنزیم میتواند نواحی هترودوبلکس ژن را شناسایی کند.M۶PR نوترکیب خالصشده از اشریشیا کلی،دارای فعالیت خاص مولکولی بود. نتایج حاصل از هضم دوگانه پلاسمید با آنزیمهای SacI و BamHI، قطعات ۲۸۷۰ جفت بازی و ۱۸۶ جفت بازی بود. قطعه حاضر مطابق با نتیجه ازمون بلاست شباهت ۱۰۰درصدی با ژن M۶PR گیاه کرفس داشت. نتایج بررسی رونویسی ژن نوترکیب M۶PR نشان داد که میزان رونویسی ژن نوترکیب M۶PR در سویههای تراریخت برابر با ۳/۲ و در کنترل ۳۲/۰ به دست آمد که تفاوت معناداری در سطح P<۰.۰۱ را از نظر آماری نشان دادند. پس از القای پیشبر و نمونه برداری در زمانهای مختلف، نمونهها روی ژل SDS-PAGE باند پروتئینی در ناحیه ۴۲ کیلو دالتون را نشان داد که نشان دهنده بیان پروتئین به صورت موفقیت آمیز بود. نتیجه گیری: همسانه سازی ژن آنزیمM۶PR بدست آمده از گیاه کرفس و به دنبال آن تولید این آنزیم به صورت نوترکیب در آزمایشگاه می تواند منجر به بیان بالای آن در سیستم پروکاریوتی شود به طوریکه آنزیم دارای فعالیت باشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که آنزیمهای گیاهی وقتی در باکتری بیان میشوند، فعال میباشند و میتوانند به عنوان منبع مناسب برای تسریع فعالیت کاتابولیک استفاده شوند.
کلیدواژه ها:
نویسندگان
عباسعلی یداللهی
استادیار، عضو هیات علمی گروه مهندسی کشاورزی، دانشگاه پیام نور
غزل قجری
دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
مراجع و منابع این مقاله:
لیست زیر مراجع و منابع استفاده شده در این مقاله را نمایش می دهد. این مراجع به صورت کاملا ماشینی و بر اساس هوش مصنوعی استخراج شده اند و لذا ممکن است دارای اشکالاتی باشند که به مرور زمان دقت استخراج این محتوا افزایش می یابد. مراجعی که مقالات مربوط به آنها در سیویلیکا نمایه شده و پیدا شده اند، به خود مقاله لینک شده اند :