بررسی مطالعه اثر متقابل لیپید-پروتیین بر روی فعالیت پروتیازی و ایمن سازی سلولهای کشت داده شده روده کنه هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم

کنه ها تحت راسته دیگری از آکارینا هستند که ایکسودیدا نامیده می شوند. از انگل های خارجی اغلب مهرداران بخصوص پستانداران می باشند. کنه ها بطور مستقیم و غیر مستقیم به دام ها صدمه زده و سبب انتقال بسیاری از پاتوژن ها بخصوص تایلریا و بابزیا در دام ها می شوند. و از این سبب خسارات قابل توجهی می شوند. بطوریکه فایو خسارات ناشی از کنه ها را در سال ‮‭1998‬ بالغ بر یک بیلیون دلار گزارش کرده است. در حال حاضر مطالعات کسترده ی در جای جای دنیا جهت کنترل این اکتو پارازیت ها صورت می گیرد. یکی از راه های کنترل کنه ها واکسیناسیون دام ها است. در روده میانی کنه ها پروتیین های مختلفی وجود دارند که کاندید مناسبی جهت تولید واکسن بر علیه کنه می باشند. از این پروتیین ها می توان به ‭Bm‬‮‭81‬ و ‭Bm‬‮‭91‬ اشاره کرد. یکی از پروتیین های دیگر که می تواند کاندیدی برای تولید واکسن باشد پروتیازعای موجود در سلول های روده میانی کنه ها است. چراکه با تزریق این پروتیازها به بدن دام ها سیستم ایمنی آنها فعال شده و برغلیه این پروتیازها آنتی بادی تولید می شود بطوریکه وقتی که خون این دام ها توسط کنه ها بلعیده می شود. آنتی بادی ها سبب مهار پروتیازهای سیستم گوارش کنه ها می گردد. لذا در عمل هضم کنه ها اختلال ایجاد شده و سبب مرگ آنها می شود. هدف مطالعه حاضر از یک طرف شناسایی پروتیازهای موجود در سلول های روده کنه بومی ایران ( هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم) و از طرف دیگربررسی اثر متقابل لیپید- پروتیین بر روی فعالیت پروتیازهای موجود در عشا سلولها است. به این منظور ابتدا روده میانی چندین کنه بدقت جدا و پس از زدودن خون بلعیده شده و جداسازی سلول ها از یکدیگر توسط کلاژناز در محیط کشت اختصاصی حشرات ‭( TC‬‮‭100‬ ) دارای فاکتور های رشد و آنتی بیوتیک کشت داده شدند. بعداز اطمینان حصول از زدوده شدن خون موجود در سلول ها کشت داده شده سلول ها جمع آوری و پس از چندین بار شستشو با بافر فسفات در یک محیط هیپوتونیک کلرید سدیم 3 در هزار غوطه ور شدند تا سلول ها متورم و غشا سلولی پاره گردد. جهت جدا کردن محتویات سیتوپلاسمی از غشا سلولی اقدام به سانتریفوژ در دور بالا گردید. همچنین جهت تایید سلول ها از تکنیک ‭PCR ‬با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن ‭IS‬2‭-r ‬استفاده شد. جهت جداسازی پروتیین های غشا سلولی از محلول 5 درصد تریتون X‮‭100‬ استفاده شد و جهت جداسازی سرین پروتیازهای غشا سلولی از تکنیک افینیتی کروماتوگرافی با استفاده از رزین ‭-Aminobenzamidine-Agarose ‬استفاده گردید. سپس غلظت پروتیین و فعالیت برخی از پروتیازها در محتویات سیتوپلاسمی، محتویات (پروتیین های) غشای سلولی و غشا دست نخورده سلولی اندازه گیری شد. جهت اندازه گیری غلظت پروتیین از روش لوری و جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم های شبه تریپسین، کیمو تریپسین، کربوکسی پپتیداز B، کاتیپسین C، کاتیپسین ‭B ‬و کاتیپسین ‭D ‬به ترتیب از ‭BAPNA‬، ‭BTPNA‬، ‭Hippuryl- Arg ‬، ‭Gly-phe-p-NA‬، Nع‭-CBZ-L-Lysine p-Nitrophenyl Ester ‬و هموگلوبین بعنوان سوبسترای استفاده شد. جهت بررسی خاصیت ایمنی زایی پروتیین های غشایی در غشا سلولی و پروتیین های جدا شده از غشا سلولهای کشت شده روده کنه ‮‭12‬ راس خرگوش نر با وزن تقریبی 1 تا ‮‭1/2‬ کیلو گرم از بخش پرورش حیوانات آزمایشگاهی تهیه شد و به 4 گروه 3 تایی ‭( A‬، B، ‭C & D ) ‬تقسیم گردیدند. به هر گروه از خرگوشها 3 نوبت آنتی ژن همراه با ادجونت فروند ( تزریق اول ادجونت کامل و دو تزریق بعدی ادجونت ناقص) تزریق شد. پس از سپری شدن سی و چهار روز از اولین تزریق، حدود ‮‭400‬ لارو گرسنه کنه هیالوما درون کیسه های پارچه ای مناسب ریخته شد و کیسه بر روی گوش خرگوش ها بسته شد. پس از ‮‭15‬ روز کیسه ها از گوش خرگوش ها باز شد و تعداد لارو های که کاملا خون خورده بودند جدا و شمارش شد. سپس با استفاده از نرم افزار ‭SSPS ‬و آزمون ‭t-Student ‬معنی دار بودن یا نبودن تفاوت های مشاهده شده در هر گروه با یکدیگر مقایسه شد. نتایج حاصل از بررسی وجود یا عدم وجود برخی از پروتیازها در پروتیین های غشایی در غشا دست نخورده، پروتیین های آزاد شده از غشا و محتویات سیتوپلاسمی نشان می دهد که در محتویات سیتوپلاسمی سلولها حاوی آنزیم های کیمو تریپسین، کربوکسی پپتیداز B، کاتیپسین C، کاتیپسین ‭B ‬و کاتیپسین ‭D ‬می باشند و غشا سلولی تنها دارای آنزیم شبه تریپسین می باشد.