بهینه سازی فرآیند انتقال ژن به ریزجلبک ‭Dunaliella salina‬

با توجه به نیاز روز افزون بشر به تامین منابع غذایی و فرآورده های با ارزش بیولوژیک و همچنین محدودیت سطوح زیر کشت محصولات کشاورزی، استفاده از پتانسیل های با ارزش سایر منابع طبیعی برای رسیدن به این اهداف از جمله مهمترین راهکار ها می باشد. در این راستا، قابلیت های منحصر به فرد جلبک های تک سلولی در کشت و تولید پروتیین های نوترکیب باعث گردیده تا در طی دهه اخیر مورد توجه فراوان قرار گیرند. ریز جلبک دونالیلا سالینا یک ارگانیسم تک سلولی بوده و فاقد دیواره ی سلولی می باشد. این ریزجلبک دارای کلروفیل می باشد و بصورت اتوتروف در حضور نور خورشید و منابع غذایی ساده در محیط آبی رشد می کند. این جلبک به عنوان مهمترین منبع برای تولید و استخراج بتاکاروتن و اسیدهای چرب غیر اشباع شناخته شده است. کشت آسان و ارزان این ریزجلبک به همراه تحمل بالای آن به شوری بالا باعث گردیده تا به عنوان یک فتوبیوراکتور به منظور تولید فرآورده های باارزش غذایی و دارویی مورد توجه قرار گیرد. دارا بودن سیستم یوکاریوتی برای بیان و پردازش پروتیین ها از جمله مزیت های استفاده از این ریز جلبک برای تولید پروتیین های نوترکیب می باشد. علاوه بر این، عدم وجود دیواره ی سلولی باعث گردیده تا فرآیند انتقال ژن به آن تسهیل گردد. در این تحقیق روش های انتقال ژن خارجی به این ریزجلبک مورد بررسی قرار گرفته و بهترین روش برای این منظور معرفی گردیده است. در اولین قدم و به منظور استفاده از نشانگرهای انتخابی در فرآیند انتقال ژن، آزمون تعیین میزان حساسیت به ترکیبات بازدارنده ی رشد از قبیل کانامایسین، هیگرومایسین، کلرامفنیکل و فسفینوتریسین انجام گردید. نتایج این آزمون حاکی از حساسیت ریز جلبک دونالیلا سالینا به فسفینوتریسین در غلظت 7 میکروگرم در میلی لیتر بود. بنابراین ژن ‭bar‬، کدکننده ی پروتیین فسفینوتریسین ترانسفراز، به عنوان ژن انتخابگر برای فرایند انتقال ژن به این ریزجلبک معرفی گردید. برای انتقال ژن از روشهای همزدن با ذرات شیشه، الکتروپوریشن و بمباران با تفنگ ژنی استفاده شد. سازه ها ی مورد استفاده در این تحقیق شامل ‮‭3301‬ ‭pCAMBIA ‬،حاوی ژن گزارشگر ‭GUS ‬و ژن انتخابگر ‭bar ‬تحت پروموتور ‮‭35‬‭S ‬ویروس موزاییک گل کلم و ‭pU GUS ‬حاوی ژن گزارشگر ‭GUS ‬و پروموتور یوبی کوییتین امگا و همچنین ‭pSS-rfp ‬حاوی پروموتور ‮‭35‬‭S ‬ویروس موزاییک گل کلم و ژن گزارشگر ‭GFP ‬بود. در فرآیند تراریختگی، تیمارهای موثر در انتقال ژن از قبیل روش ترانسفورماسیون و سایر عوامل جهت تولید جلبک تراریخته بر روی محیط کشت انتخابی مورد بررسی قرار گرفت نتایج حاصله حاکی از موفقیت آمیز بودن روش استفاده از ذرات شیشه و همراهی پروموتور ‮‭35‬‭S ‬در فرآیند انتقال ژن بوده است. در این روش سلول های جلبک تراریخته قابلیت رشد خود را در محیط کشت حاوی نشانگر انتخابی فسفینوتریسین حفظ نموده و حضور ژن های ‭GUS ‬و نشانگر انتخابی با استفاده از روش ‭PCR ‬تایید شد. همچنین بیان ژن ‭GUS ‬در سلول های تراریخته، با استفاده از رنگ آمیزی هیستوشیمیایی مورد تایید قرار گرفت. کلمات کلیدی: دونالیلا سالینا، علف کش باستا، ژن ‭bar‬، ژن ‭GUS‬، همزدن با ذرات شیشه، الکتروپوریشن